大量全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型)

Maxi Blood DNA Isolation Kit(Solution)

包裝規格：

一. 產品介紹：

本試劑盒根據全血特點采用幾個快速步驟提取基因組DNA，首先紅細胞裂解液裂解去除不含DNA的紅細胞，細胞核裂解液裂解白細胞釋放出基因組DNA， 然后蛋白沉淀液選擇性沉淀去除蛋白，最后純凈的基因組DNA通過異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液，操作步驟簡單，實驗成本低，產量高，純度好，適合各種下游實驗。

二. 產品特點：
1.從十幾個配方中優選出的紅細胞裂解液配方，裂解快速完全。
2.不需要使用有毒的苯酚等試劑。
3.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在60分鐘內完成。
4.結果穩定，產量高（典型的產量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可達50Kb-150kb，可直接用于構建文庫、PCR、Southern-blot和各種酶切反應。

三. 適用范圍：
適用于快速提取各種動物全血基因組DNA。

四. 試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存18個月不影響使用效果。

五. 儲存事項：
1.環境溫度低時細胞核裂解液中某些去污劑成份會析出出現渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
2.蛋白沉淀液可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影響使用效果，直接取用上層溶液即可。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

六. 注意事項
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到2500 x g， 4000rpm以上，并配備容納50ml離心管轉頭的傳統臺式離心機。
2.建議采用PP材質，可高溫高壓滅菌，50ml直口圓底離心管，不用擰螺旋蓋，方便開蓋，在本實驗中，直口圓底離心管方便清洗，經過多次漂洗消毒滅菌，可重復使用，降低實驗成本。   
3.用戶需自備異丙醇和70％乙醇。
4.典型的產量10ml全血可提取出150-500μg 基因組DNA，不同樣品尤其疾病樣品中白細胞數量差異可能非常大，因此產量的個體差異也可能非常大。
5.溶液型全血基因組DNA提取方法，可以很容易的按照比例擴大或者縮小每次處理的全血量（20μl-10ml），需要具體產品操作說明，請聯系我們索取不同處理量的操作說明書。
6.本試劑盒可運用于多種抗凝劑的全血，如EDTA、檸檬酸、肝素抗凝血。其中由于肝素抗凝血的白細胞沉淀團很難打散重懸，影響裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標本。
7.為了最佳效果，最好使用新鮮血液標本或者4℃存放小于3天的標本，不要使用反復凍融超過3次的標本，否則會嚴重降低產量。
8.對于每個樣品提取血量大或者用量大的客戶，可以和我們聯系，我們另外專門準備有優惠的大包裝試劑。

七. 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
本試劑盒為溶液型，可按照比例擴大或縮小每次處理的全血量（20μl-10ml）

1.吸取25ml 1x紅細胞裂解液（需要先稀釋到1x）到一個50ml離心管。使用前應該用去離子水將10x紅細胞裂解液稀釋10倍到1x。

2.將抗凝全血（使用前回復到室溫）顛倒混勻后，吸取10ml全血加到上步裝有紅細胞裂解液的50ml離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。

3.室溫放置10分鐘，期間顛倒混勻6-8次，也可放在漩渦震蕩儀或搖床上震蕩混勻幫助裂解紅細胞。

4.2500 x g，4000rpm臺式離心機離心2分鐘，倒棄紅色上清，在吸水紙上倒扣離心管吸凈管口殘留的血液。

   可選步驟，再加入3-5ml紅細胞裂解液上下顛倒幾次，靜置1-2分鐘，2500 x g，4000rpm離心2分鐘，之后倒棄紅色上清，兩次紅細胞裂解DNA純度更好。

5.加入10ml細胞核裂解液用巴氏吸管迅速有力的上下吹打5-10次以裂解白細胞（吹散白細胞團步驟非常重要，不可省略），然后在60-65℃水浴鍋或烘箱中恒溫放置30-60min左右，具體時間看白細胞裂解狀況而定。
  備注：劇烈渦旋震蕩和迅速吹打可以幫助細胞核裂解液和白細胞接觸并裂解，由于基因組DNA立刻釋放出來，混合物會馬上變得十分粘稠，就應停止吹打，以免剪切斷基因組DNA。

6.可選步驟，一般不需要：在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至終濃度30μg/ml，顛倒25次混勻，37℃溫育15分鐘去除殘留RNA，然后冷卻回室溫。

7.將所有離心管從水浴鍋或烘箱中從取出，加入3.33ml蛋白沉淀液后，在渦旋振蕩器上高速連續振蕩混勻25秒，混勻后可能見到一些小的蛋白團塊，也可以用巴氏吸管迅速有力的上下吹打5-10次，這樣混勻效果更好。

8.2500 x g，4000rpm離心5-10分鐘。這時候應該可以見到管底暗褐色的蛋白沉淀，也可能見到一些蛋白沉淀漂浮在液體表面。

9.小心吸取或者倒出上清（約10-12ml）到一個新的50ml離心管中。吸取上清時，注意不要吸到管底和漂浮在液體表面的蛋白沉淀，如果不小心將蛋白沉淀轉入新的離心管中，可再次離心2分鐘后取上清。

10.加入等體積的室溫異丙醇10-12ml，輕柔顛倒30次混勻或者直到出現棉絮狀（絲狀）白色DNA沉淀。
可選方案：DNA轉移結束后將50ml離心管上標記的編號用異丙醇擦凈，倒掉離心管中的溶液，然后將管子泡在放有消毒片或洗衣粉的塑料桶里浸泡半天后，將離心管用自來水沖洗刷凈，再用84消毒液浸泡一天，之后多次用清水漂洗，最后高壓滅菌重復使用。 

11.用黃槍頭吸取DNA沉淀轉移到潔凈的1.5ml EP管中，并吸凈上清液。加入300-500μl 70％乙醇，顛倒幾次漂洗DNA沉淀，12,000rpm離心1分鐘， 倒去上清（注意不要把DNA沉淀倒掉了），在吸水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，也可以用槍頭小心吸掉管底沉淀周圍和管壁的殘留乙醇，空氣晾干沉淀幾分鐘。注意不要干燥過頭，否則DNA極其難溶，也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能抑制下游如酶切反應。

12.加入100-500μl DNA溶解液重新溶解DNA沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在65℃溫育30-60分鐘（不要超過一小時），期間不時的輕彈管壁幫助重新水化DNA。也可以在室溫或者4℃放置過夜來重新水化DNA。

13.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。