BAC/PAC大型質粒提取試劑盒(溶液型,無內毒素,轉染級)

Endo-Free BAC/PAC Plasmid Maxi Isolation Kit(Solution)

包裝規格：

一.產品介紹：
   常規的離心柱型質粒抽提試劑盒并不適用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型質粒DNA的抽提。這主要是因為大型質粒DNA分子量很大，常常會超過100kb而且一般拷貝數低產量低，使用常規的離心柱吸附膜吸附效率和產量很低而且過膜會打斷這些大分子量的質粒DNA。本試劑盒采用改進堿裂解法從培養菌中提取質粒DNA，采用獨特的溶液配方和內毒素清除試劑，只需要幾次簡單離心去除蛋白質、多糖、內毒素、RNA等雜質，獲得高質量的質粒DNA。純化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的質?？芍苯討糜诩毎D染甚至動物體內實驗等對DNA純度要求很高的工作中。純化后期過程均在1.5ml離心管中操作，方法簡單，不需特殊設備，無需過柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收細菌裂解釋放出的質粒，不必擔心質粒DNA的丟失。本方法提取純化質粒DNA，對質粒損傷小，即使是100kb甚至200kb以上的大型質?；虺笮虰AC/PAC質粒，只要堿裂解法能夠提取，就可以有效純化。此外溶液型的試劑可以按照比例放大縮小進行小提/中提/大提，最后可選擇任意小體積溶解質粒，濃度可高達3μg/μl。

二.產品特點：
1.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、 方便、從150 ml大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養液中，可快速提取典型產量30-50μg高純度BAC質粒DNA，提取率達80-90 %。
2.獲得的質粒產量高，超螺旋比例高，純度好，可直接用于轉染、測序、文庫等各種分子生物學實驗。
3.內毒素含量極低（< 0.1 EU/μg DNA），可直接應用于細胞轉染。

三.適用范圍：
   適用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型質粒制備

四.儲存條件：
1.第一次使用時，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后（終濃度100μg /ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質?？赡軙祀s有微量RNA殘留，在溶液P1中補加RNase A即可。
2.內毒素清除劑在4℃可保存一個月，如果要長期保存，建議保存在－20℃!
3.環境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出出現渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
4.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?0kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。

2.提取大質粒時操作動作要輕柔，應該使用剪大了開口的吸頭，防止機械剪切對DNA的損壞。

3.DNA沉淀液沉淀離心后，可能看不到明顯沉淀。如未見沉淀，擔心DNA丟失，可保留上清液，待完成全部操作后電泳鑒定，以確定是否獲得終產物（數百微克DNA離心沉淀在管的側壁上，可能無法看到明顯團塊）。

4.得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過95%

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
  提示：將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，使用后置于2-8℃保存。
1.取過夜培養菌150 ml左右菌液（最大不超過180ml-200ml），裝入合適的離心瓶中，10,000 x g于4℃離心2 min沉淀菌體，完全棄除上清。

2.加入5 ml 溶液P1，充分混懸震蕩菌體沉淀，使其完全分散開，至無絮塊存在。細菌懸液移入50 ml離心管中，室溫放置3~5 min。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

3.加入5 ml 溶液P2，輕輕顛倒離心管6~8次，室溫放置4-5 min，使細菌完全裂解，溶液透明。溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時不應超過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。

4.加5 ml溶液PⅢ，立即顛倒離心管6~8次，充分混勻，至白色絮狀物產生。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g離心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml離心管中。加入溶液PⅢ后應該立即混勻，以免產生SDS的局部沉淀。

5.加入10 ml 異丙醇，顛倒離心管，充分混勻。
注意：使用異丙醇沉淀，蛋白雜質和鹽離子共沉淀較少，可能看不到明顯的較大團塊沉淀，但是質粒還是可以完全沉淀下來，不影響實際的質粒產量。如果你習慣看見較大的沉淀團塊操作，可以選擇2倍體積的無水乙醇沉淀。

6.于4℃ 12,000~16,000 x g離心10 min，小心棄去上清，倒置于吸水紙上輕輕瀝干殘余液體，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速離心5分鐘，棄上清，晾干沉淀。DNA沉淀如果干燥過頭，DNA將無法完全溶解，但是如果乙醇沒有晾干揮發干凈，殘留太多，也會造成DNA無法完全溶解。
注意：異丙醇離心沉淀后，質粒純度很高吸附在管底和側壁可能看不見沉淀，但是不影響產量，后續步驟仔細吹打管底和沉淀所在的側壁涮洗溶解質粒。

7.加入1.4 ml 溶液P1完全溶解沉淀團塊，注意附著在管底和側壁上的質粒沉淀雖然可能看不見，也要吹打管底和沉淀所在的側壁涮洗下來（大質?？捎脤捒谖茌p輕吹打輔助溶解）。然后將質粒溶液轉入2個新的1.5 ml離心管中（每個700μl）。
可選步驟（一般不需要）：如果菌株RNA豐富有微量RNA殘留，可在此步驟后將質粒溶液 60℃孵育15 min消化RNA。

8.每管加入55μl雜質清除液A，顛倒充分混勻后加入約0.1體積(約80μl)冰預冷的內毒素清除劑，顛倒旋轉7-10次（30秒左右）充分混勻，冰浴或者冰上放置>=5分鐘，中間偶爾顛倒混勻幾次。
內毒素清除劑加入上清后，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮。
注意：如果不需要去內毒素用于轉染，可在此步驟只加入55μl雜質清除液A，充分混勻后冰上放置5分鐘，離心后小心取上清轉入一個新管，直接接步驟11。

9.42℃水浴，溶液又會變為渾濁，顛倒混勻后42℃溫育5分鐘。

10.室溫14,000 x g離心5 min分相（溫度低時，內毒素清除劑無法分相，因此必須至少20℃以上室溫離心或者保證冬季轉頭溫度20℃以上）。上層水相含DNA，下層藍色油狀相含內毒素和其它雜質。將含DNA的上層水相轉移到新管（注意不要吸到藍色油狀層，里面含內毒素等雜質），棄油狀層。
溶液必須分為上下兩相，否則應重復步驟9-10。

11.將上一步所得上層水相中加入等體積雜質清除液B（約750μl），輕柔混勻，4℃ 14,000 x g離心10 min，棄上清（注意不要丟失DNA），輕輕加入1 ml 70%乙醇洗滌，離心棄上清，共兩次，室溫倒置晾干5~10 min使乙醇完全揮發。

12.每個離心管加適量TE或者純水（50~100μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振蕩以輔助溶解）。要注意很多質粒DNA可能附著在離心管側壁上，即使看不見，也應該充分吹打側壁溶解回收質粒DNA。

最后沉淀可以根據需要選擇任意小體積溶解，這樣可以得到很高濃度的轉染級質粒DNA（高達3-5μg/μl）。如果有需要，客戶也可以選擇更大體積溶解。