高純度質粒大量快速提取試劑盒(離心柱型)

HighPure Plasmid Maxi Extraction Kit(SpinColumn)

包裝規格：

產品介紹：
本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH 值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。

儲存事項:
1. 第一次使用時， 將試劑盒所帶全部的RNaseA加入溶液P1后（ 終濃度100μg/ml ）置于4 ℃ 保存 。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質粒可能會有微量 RNA 殘留，在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。
2. 環境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出出現渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH 值變化，各溶液使用后應 及時蓋緊蓋子。

產品特點：
1. 離心吸附柱內硅基質膜采用進口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，從100-200ml 大腸桿菌 LB((Luria-Bertani)培養液中，可快速提取 0.2-0.5mg 純凈的高拷貝質粒 DNA，提取率達 80 %左右。
3. 獲得的質粒產量高、超螺旋比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、
體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項：
1. 所有的離心步驟如未加另外說明均在室溫完成，使用轉速可以達到12,000xg，帶50ml轉頭的臺式離心機。
2. 溶液P3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套， 避免沾染皮膚 、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
3. 提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脫緩沖液應在70℃預熱。可以適當的延長吸附和洗脫的時間，提高提取效率。
4. 得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。 電泳可能為單一條帶，也可能為2 2 2 2 條或者多條DNA 條帶 ，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。 本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90% 。
5. 質粒 DNA 確切分子大小， 必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道 。處于環狀或者超螺旋狀態的質粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。
6. 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA ，不影響下游酶切、連接等反應。 也可以使用水洗脫，但應該確保 pH 大于 7.5 ，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，質粒應該保存－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：
第一次使用前請先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
將 RNaseA 全部加入溶液 P1 中，混勻。每次使用后置于 2-8℃保存。
將溶液 P3 放在冰上預冷。
1. 取 150-200 毫升過夜培養的菌液，12,000xg，離心 1-2 分鐘，盡可能的倒干上清 ，收集菌體。
收集超過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50ml管內加入更多的菌液 ，
重復步驟 1，直到收集到足夠的菌體。
2. 用 7ml 溶液 P1 重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。
3. 加 7ml 的溶液 P2，溫和地上下翻轉 4 -7 次使菌體充分裂解，室溫放置 3-5 分鐘。
溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組 DNA  剪切斷裂！所用時間不應超過 5分鐘 ！ 以免質粒受到破壞 。 此時菌液應變得清亮粘稠 。 如果 很渾濁 ， 可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。
4. 加 10ml 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉 4 -7 次，充分混勻此時會出現白色絮狀沉淀。室溫或者冰上靜置5分鐘，4℃ ，12,000xg 離心15分鐘，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
加入溶液P3后應該立即混勻 ， 以免產生SDS的局部沉淀 ， 如果上清中還有 飄浮白色沉淀，可再次離心后取上清。
5. 可選 （一般不需要做）:4℃，12,000xg 再次離心 10 分鐘，小心取上清。
6. 將上一步所得上清分多次（每次不超過 15ml）轉入吸附柱 DC 中（吸附柱放入收集管中），12,000xg 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液。
7.加入 10ml 去蛋白液 PD，12,000xg 離心 1 分鐘，棄掉廢液。
8. 加入 10ml 漂洗液 WB （請先檢查是否已加入無水乙醇!） ），12,000xg 離心 1 分鐘 ，棄掉廢液。
9. 重復操作步驟 8 一次。
10. 將吸附柱 DC 放回空收集管中，最高速（最好大于 12,000xg）離心 5 分鐘以干燥膜基質殘留乙醇，用槍頭吸除內圈壓環和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。
該步驟目的為徹底去除吸附柱中殘留乙醇 ， 殘留乙醇抑制下游反應并且嚴重降低洗脫效率，降低質粒產量驟 。如果洗脫產量低，則必須加做步驟  11 。
11. 可選步驟:選擇以下兩種方法之一干燥柱子：
1) 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空 15 分鐘；
2) 將柱子放置于 60－65℃真空干燥箱或烘箱中，放置 10-15 分鐘。
12. 取出吸附柱 DC，放入一個干凈的離心管中， 在吸附膜的中間部位加 1-2ml 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置 2-5 分鐘，12,000xg 離心 5 分鐘。如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心2分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積 ，
但是最小體積不應少于1ml，體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量。

問題與解決方法：