植物microRNA提取試劑盒(離心柱型)

Plant microRNA Extraction Kit(Column)

包裝規格：

一.產品介紹：
植物microRNA快速提取試劑盒，獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶，植物RNA助提劑PLANTaid幫助結合多糖多酚并通過離心去除，然后裂解混合物通過基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA（包括microRNA）被選擇性濾過。濾過的RNA用乙醇調節結合條件后，RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜， 再通過一系列特殊漂洗液快速的漂洗－離心的步驟,將細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA（包括microRNA）從硅基質膜上洗脫。采用分提取操作步驟也可單獨純化富集后的microRNA組分和總RNA（>200 nt）從而得到分離富集的microRNA和RNA。

二.產品特點：
1.完全不使用有毒的苯酚，氯*等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內完成。
3.獨有的植物RNA助提劑可以有效結合多糖多酚,提高清除效果。
4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達2.0～2.2，可用于RT-PCR，Northern-blot和各種實驗。

三.適用范圍：

    適用于快速提取植物microRNA或者microRNA/總RNA分別提取。

四.儲存條件：
1.所有的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清。
2.不合適的儲存于低溫（4℃或者－20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行。
3.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用幾天后出現沉淀晶體，并不影響使用，直接不吸晶體，吸上清使用就可以。
4.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.所有的離心步驟均可在室溫完成（4℃離心也可以），使用轉速可以達到13,000 rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

2.需要自備乙醇，β-巰基乙醇，研缽(可選)。

3.樣品處理量絕對不要超過基因組清除柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或產量降低。開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時可使用較少的樣品處理量，將來根      據樣品試驗情況增加或者減少處理量。

4.裂解液RLT Plus 和Wash Solution 1中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，用大量清水或者生理鹽水沖洗。 

5.關于DNA 的微量殘留：
  一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），該產品由于采取了本公司獨特的緩沖體系和基因組DNA清除柱技術，絕大多數DNA已經被清除，個別特殊情況需要清除微量基因組DNA殘留，可使用以下幾種DNA酶消化的方式。

 1)傳統DNA酶消化提取的RNA/microRNA，熱滅活DNA酶后直接用于后續實驗。

 2)傳統DNA酶消化提取的RNA/microRNA，然后使用RNA清潔純化試劑盒（貨號：2131)清潔純化后用于后續實驗。

 3)直接在吸附柱RA上進行DNase I柱上消化處理。購買DNA酶柱上消化試劑盒(貨號：2127) 。

6.碰到特別復雜多糖多酚，淀粉等次級代謝產物特別豐富的樣品，如葡萄果實，水稻種子，裂解液RLT Plus效果不佳的情況下，應該購買專用裂解液CLB。

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
    第一次使用前請先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶加入指定量無水乙醇!
    對于RNA酶或者多酚特別豐富植物組織：操作前在裂解液RLT Plus中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT Plus 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的RLT Plus 4℃可放置一個月。
1.直接研磨法（提取簡單植物樣品推薦此法，但是簡單樣品也可以用液氮研磨法）:

 a.新鮮植物組織稱重后取100mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100mg放入研缽）， 加入10體積（1ml）RLT Plus和1體積（100μl） PLANTaid 室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和裂解液RLT Plus立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。

注：PLANTaid是提取多糖多酚次級代謝產物色素含量豐富的困難樣品不可缺少成分。
 b.將裂解物轉入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid。

 c.取480μl裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產量，如殘留基因組DNA較多，可適當減少取上清量）將裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱      放在收集管內）。

 d.立刻接操作步驟的步驟3。

2.液氮研磨法（提取復雜，易降解樣品時推薦此法）:

a.取500μl裂解液RLT Plus，轉入1.5ml離心管中，加50μl PLANTaid混勻備用。

b.液氮中研磨適量植物組織成細粉后，取50mg細粉轉入上述裝有RLT Plus和PLANTaid的離心管, 立即用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

c.用吸頭吹打混勻幫助裂解或者劇烈渦旋震蕩直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產量。

d.將裂解物13,000 rpm離心5-10分鐘，沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid。

e.取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產量）將裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管內）。

f.立刻接操作步驟的步驟3。

注意：以上液氮研磨法用戶可以根據需要加倍處理，可以提高產量。也就是使用1ml的裂解液RLT Plus和100μl PLANTaid和100mg的樣品。
3.立即13,000 rpm離心60秒，收集濾液（RNA在濾液中）。

4.用微量移液器較精確估計濾過液體積（480μl左右，濾過時候損失體積應該減去），加入1.25倍體積的無水乙醇，此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

5.立刻將混合物(每次小于700μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。
  確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。

6.加700μl Wash Solution 1（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7.加入500μl Wash Solution 2/3（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl Wash Solution 2/3，重復一遍。

8.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

9.取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。
  將洗脫液加回到吸附柱重復洗脫步驟一遍可以提高產量約10-15%。

10.得到的RNA/microRNA可以立即用于下游反應或者盡快置于低溫保存。

附錄1：microRNA富集方法（microRNA/去除了microRNA的總RNA分別提?。?br />      第一次使用前請先在漂洗液RW瓶加入指定量無水乙醇!
     對于RNA酶或者多酚特別豐富植物組織：操作前在裂解液RLT Plus中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT Plus 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的RLT Plus 4℃可放置一個月。

1.直接研磨法（提取簡單植物樣品推薦此法，但是簡單樣品也可以用液氮研磨法）:

 a.新鮮植物組織稱重后取100mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100mg放入研缽）， 加入10體積（1ml）RLT Plus和1體積（100μl） PLANTaid 室溫下充分研磨    成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和裂解液RLT立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。

注：PLANTaid是提取多糖多酚次級代謝產物色素含量豐富的困難樣品不可缺少成分。

 b.將裂解物轉入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid。

 c.取480μl裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產量，如殘留基因組DNA較多，可適當減少取上清量）轉到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。

 d.立刻接富集方法的步驟3。

2.液氮研磨法（提取復雜，易降解樣品時推薦此法）:
 a.取500μl裂解液RLT Plus，轉入1.5ml離心管中，加50μl PLANTaid混勻備用。

 b.液氮中研磨適量植物組織成細粉后，取50mg細粉轉入上述裝有RLT Plus和PLANTaid的離心管, 立即用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

 c.用吸頭吹打混勻幫助裂解或者劇烈渦旋震蕩直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產量。

 d.將裂解物13,000 rpm離心5-10分鐘，沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid。

 e.取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產量）轉到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現沉淀,但是不影響提    取過程，立即吹打混勻,不要離心。

 f.立刻接富集方法的步驟3。
注意：以上液氮研磨法用戶可以根據需要加倍處理，可以提高產量。也就是使用1ml的裂解液RLT Plus和100μl PLANTaid和100mg的樣品。

3.將混合物(每次小于720μl，多可以分兩次加入)加入一個基因組清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm離心2分鐘，保留濾液（microRNA在濾液中）。此時，濾過液含有microRNA，基因組DNA清除柱子上面是去除了microRNA的總RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面標準操作步驟6－10操作漂洗，洗脫回收得到去除了microRNA的總RNA。

4.用微量移液器較精確估計濾過液體積，加入0.65倍體積無水乙醇（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

5.立刻將混合物(每次小于700μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。

6.按照前面標準操作步驟6－10操作漂洗，洗脫得到富集的microRNA。 
注意：不同的實驗可以選擇不同的方法，例如Northern Blot或者表達芯片譜分析可以選擇提取包括microRNA的總RNA。富集方法提取的microRNA因為去除了較大片段的mRNA和rRNA等，可能減少某些下游試驗的擴增背景，當背景較高或者非特異擴增較多時，可以嘗試使用富集方法提取的microRNA。

附錄2：DNA酶柱上消化（詳細請參考2127 DNase I 柱上消化試劑盒說明書)
1.按照前面所列操作步驟操作，直到做完操作步驟5。
2.取45μl DNase I buffer和5μl RNase free DNase I在離心管輕輕吹打混勻成工作液（處理多個離心柱子要按照比例放大制備工作液）。

3.向吸附柱RA 中加入350μl Wash Solution 1，12,000 rpm 離心30 秒，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。

4.向吸附柱RA 中央加入50μl的DNase I 工作液，室溫（20℃-30℃）放置15 分鐘。注意直接將工作液滴在膜中央上向膜四周浸潤充分和膜接觸，不要讓工作液滴在O型墊圈或是離心柱管壁上掛壁或    者掛在墊圈上不能充分和膜接觸。

5.向吸附柱RA 中加入350μl Wash Solution 1， 12,000 rpm 離心30-60 秒，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。

6.接操作步驟7完成后續步驟。

附錄3：植物microRNA快速提取試劑盒使用裂解液CLB操作步驟
      第一次使用前請先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶加入指定量無水乙醇!
      取1ml裂解液 CLB至離心管內(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解）， 在裂解液CLB中加入5%?-巰基乙醇（1ml CLB加50μl ?-巰基乙醇）。顛倒混勻后65°C水浴中預熱。
1.液氮中研磨新鮮或-70°C冷凍的材料至細粉。

2.轉移100-150mg細粉（水分少的樣品如種子葉片等可加100mg，水分多的樣品如西瓜可多加一些）加至預熱的裂解液CLB（已加有?-巰基乙醇）離心管中，立即激烈渦旋30－60秒或者用吸頭吹打   混勻裂解，短時放回 65°C水浴中（5 min），中間偶爾顛倒1-2次幫助裂解。
  ?-巰基乙醇是裂解液CLB的關鍵成分，必要的時候可以提高終濃度到10-20%。
3.振蕩混勻后室溫13,000rpm離心10分鐘。

4.取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產量）轉到一個新離心管。
  若上清表面有漂浮物，用吸頭挑開吸取下面液體即可。

5.立刻接后續操作步驟。

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