組織/細胞microRNA提取試劑盒(離心柱型)

Tissue/Cell microRNA Extraction Kit(Column)

包裝規格：

本產品僅用于科研，禁止用于醫藥、臨床醫療、食品和化妝品等用途。

一.產品介紹：
    近年來對RNA干擾和調節性小RNA的廣泛研究迫切需要一種能有效提取15?-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的試劑盒。但是傳統的RNA提取方法如硅膠膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。本試劑盒采用獨特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶，強烈有機抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于離心柱內特殊硅基質膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質進一步去除， 最后低鹽的洗脫液將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。

二.產品特點：
1.離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。
2.也不需要乙醇沉淀等容易喪失微小分子RNA的步驟。
3.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內完成。
4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無DNA殘留,可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各種實驗。

三.適用范圍：
   適用于快速提取各種細胞組織miRNA和其它各種小RNA。

四.儲存條件：
1.Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入無水乙醇后，可以在常溫保存。
2.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用幾天后出現沉淀晶體，并不影響使用，直接不吸晶體，吸上清使用就可以。
3.運輸在常溫下進行，不影響使用效果。
4.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.第一次使用前請先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后請及時打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
2.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13，000 rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
3.需要自備乙醇，氯*，一次性注射器，研缽。
4.Lysis/Binding buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5.預防RNase 污染，應注意以下幾方面：
 1)經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase 污染。
 2)使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
 3)RNA 在裂解液中時不會被RNase 降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。
 4)配制溶液應使用無RNase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高壓滅菌。）
6.RNA 純度及濃度檢測：
完整性：RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電泳緩沖液；150v，15 分鐘)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后UV 下應能看到非常明顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大小分別約為5 kb 和2kb，分別相當于28S 和18S rRNA。動物RNA 樣品中最大rRNA 亮度應為次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質污染程度的指標。高質量的RNA，OD260/OD280 讀數（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間。OD260/OD280 讀數受測定所用溶液的pH 值影響。同一個RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數1.8-2.1 之間，在水溶液中所測讀數則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將分光光度計調零，取稀釋液進行OD260, OD280 測定，按照以下公式進行RNA濃度的計算：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數n)×40。

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
   提示：
         第一次使用前請先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇！
1.組織培養細胞
 a.收集<107懸浮細胞到一個1.5ml離心管。（對于貼壁細胞，孔板培養和細胞瓶培養可以直接裂解，盡可能吸干凈所有培養液殘留后直接加入1ml的Lysis/Binding buffer, 迅速輕搖使Lysis/Binding buffer充分和瓶底所有細胞接觸裂解細胞并滅活RNA酶，輕輕用移液槍反復吹打混勻接操作步驟項下3。）

 b.13，000rpm離心10秒（或者300g離心5分鐘），使細胞沉淀下來。完全吸棄上清，留下細胞團，注意不完全棄上清會稀釋裂解液導致產量純度降低。

 c.輕彈管壁將細胞沉淀完全松散重懸，加入1ml Lysis/Binding buffer，渦旋或者吹打，充分裂解混勻。

 d.接操作步驟項下3。

2.動物組織（例如鼠肝腦）
 a.新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊,根據處理組織的質量，按照50-100mg加入1ml的比例加入Lysis/Binding buffer后電動或者手動徹底勻漿。或者在液氮中研磨組織成細粉后，取適量組織細粉（約50-100mg）轉入裝有1ml Lysis/Binding buffer的1.5ml離心管中,劇烈吹打渦旋混勻。

 b.可選,一般不需要：如果處理量大,有明顯顆粒或者不溶物,非常粘稠或者裂解不充分, 可立即用帶針頭的一次性 5 ml(約0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產量。

 c.接操作步驟項下3。

3.室溫放置5分鐘以充分分離核酸蛋白復合物。

4.加入200μl 氯*，劇烈振蕩15秒。

5.室溫放置2-3分鐘，13，000rpm離心10分鐘。

6.小心取上清（約600μl）轉入到新的離心管，加入1.5倍體積的無水乙醇（必須是室溫的，通常900μl），渦旋混勻。此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心，立刻接下步。

7.將混合物(每次小于700μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm離心30-60秒，棄掉廢液。

8.加700μl Wash Solution 1（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12，000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

9.加入500μl Wash Solution 2/3（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl Wash Solution 2/3,重復一遍。

10.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

11.取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 100℃水浴中預熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。

12.如果預期RNA產量>30μg,加30-50μl RNase free water重復步驟11, 合并兩次洗脫液,或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。
洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高, 分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高1 5–30%, 但是濃度要低,用戶根據需要選擇。

附：microRNA富集方法（僅僅提取microRNA，不包含>200 nt其它總RNA成份。）
1.按照前面標準操作步驟1－5操作，直到得到上清。

2.較精確估計上清體積（約600μl），加入等體積70％乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

3.將混合物加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm離心30-60秒，收集濾過物。將濾過物從收集管轉移到一個新的離心管后，把吸附柱子放回空的收集管內，再加入剩下的混合物，離心，收集濾過物。合并兩次濾過物，計算體積。此時，濾過物含有microRNA, 吸附柱子上面是除去了microRNA的總RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面標準操作步驟8－11操作漂洗，洗脫回收得到去除了microRNA的總RNA。

4.較精確估計濾過物體積，加入0.65倍體積無水乙醇（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

5.取一套新的microRNA吸附柱MA，將上一步驟混合物(每次小于700μl,多可以分兩次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。

6.按照前面標準操作步驟8－11操作漂洗，洗脫得到富集的microRNA。

注意：不同的實驗可以選擇不同的方法，例如Northern Blot或者表達芯片譜分析可以選擇提取包括microRNA的總RNA。富集方法提取的microRNA因為去除了較大片段的mRNA和rRNA等，可能減少某些下游試驗的擴增背景，當背景較高或者非特異擴增較多時，可以嘗試使用富集方法提取的microRNA。

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