凝固全血基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(0.1-1mL)

Coagulated Blood DNA Extraction Kit(SpinColumn,0.1-1mL)

包裝規(guī)格：

一.  產(chǎn)品介紹：

本試劑盒可以高效提取凝固血塊中的基因組DNA，獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的， 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.  產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等。

2.快速，簡捷，單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。

3.多次柱漂洗確保高純度，典型的產(chǎn)量1ml全血可提取出15-20μg基因組DNA，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長度可達(dá)30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

4.典型的產(chǎn)量200μl全血可提取出3-6μg 基因組DNA。

三.  適用范圍：

適用于快速提取提取0.1-1ml凝固血塊中的基因組DNA。

四.  儲存條件：

1.裂解液TL、結(jié)合液CB、或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

2.為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。

3.避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.  注意事項(xiàng)：

1.所有的離心均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機(jī)，如Eppendorf5415C或者類似離心機(jī)。

2.需要自備1ml不帶針頭的一次性輸液器和異丙醇。

3.不同樣品尤其疾病樣品中白細(xì)胞數(shù)量差異可能非常大，因此產(chǎn)量的個(gè)體差異也可能非常大。

4.開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃?zhèn)溆谩?

5.為了最佳效果，最好使用新鮮血液標(biāo)本或者4℃存放少于3天的標(biāo)本，不要使用反復(fù)凍融超過3次的標(biāo)本，否則會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。

關(guān)于平衡液的使用:

1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強(qiáng)堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。

2.使用方法：（臨用前才預(yù)處理）取一個(gè)新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液預(yù)處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

六.  操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

平衡液預(yù)處理吸附柱備用：

使用平衡液預(yù)處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關(guān)于平衡液的使用”

1.在0.1-1ml凝固血塊中，用解剖刀取大約20-50mg凝固血塊切成小碎塊后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，用手持式組織研磨儀研磨勻漿（貨號：GE002-18K），或者在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，之后加900ul 1x紅細(xì)胞裂解液，渦旋震蕩混勻，室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次，幫助裂解紅細(xì)胞）。

2.12,000 rpm離心1min，吸棄紅色上清，留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約10μl的殘留上清，再用手持組織研磨儀均質(zhì)5-10秒，再加900ul 1x紅細(xì)胞裂解液，渦旋震蕩混勻，室溫放置5分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次，幫助裂解紅細(xì)胞）。

3.12,000 rpm離心1min，吸棄紅色上清，留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約10μl的殘留上清。

4.200μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中，渦旋振蕩重懸白細(xì)胞團(tuán)。

5.加入30μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。

6.將裂解物放置在55℃水浴3小時(shí)或者直到組織消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。

可選做步驟:如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟6后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

7.冷卻后如果還有未溶解的凝血血塊，用1ml不帶針頭的一次性輸液器反復(fù)抽吸10次，再加入200μl 結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。

8.冷卻后加100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

9.用1ml的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。

上述步驟中凝固血塊充分溶解，以及立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15秒混勻。

10.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

11.加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

12.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

13.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

14.取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

15.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間存放，可以放置在-20℃。