全血組織/細胞基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)

Blood/Tissue/Cell DNA Extraction Kit(Column)

包裝規格：

一.產品介紹：

獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的， 抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。

二.產品特點：
1.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等。
2.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內完成。
3.多次柱漂洗確保高純度，典型的產量200μl全血可提取出3-6μg，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可達30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各種酶切反應。
4.從十幾個配方中優選出的紅細胞裂解液配方，裂解快速完全，客戶可根據需要選擇購買。
5.典型的產量200μl全血可提取出3-6μg 基因組DNA。

三.適用范圍：
   適用于快速提取全血、多種動物細胞和動物組織等。

四.儲存條件：
1.裂解液TL、結合液CB、或者抑制物去除液IR低溫時可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2.為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中發生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.所有的離心均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000 rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2.需要自備1XPBS(磷酸鹽緩沖液),和異丙醇。
3.不同樣品尤其疾病樣品中白細胞數量差異可能非常大，因此產量的個體差異也可能非常大。
4.開始實驗前將需要的水浴先預熱到70℃備用。
5.為了最佳效果，最好使用新鮮血液標本或者4℃存放少于3天的標本，不要使用反復凍融超過3次的標本，否則會嚴重降低產量。

關于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵埃發生反應而影響其核酸的結合能力。硅膠柱經平衡液預處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團，提高核酸的結合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產量。平衡液是強堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：（臨用前才預處理）取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時平衡液預處理柱子完畢。接后續的操作步驟。

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
  提示：第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
平衡液預處理吸附柱備用：
使用平衡液預處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關于平衡液的使用”

1.全血
a.取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。
如果全血起始量小于200μl，則用緩沖液BB補足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間，則后續操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1ml之間，則需要先進行紅細胞裂解操作（見本說明書后附錄）。
如果處理血樣為禽類、鳥類、兩棲類或更低級生物的抗凝血液，其紅細胞為有核細胞，因此處理量5-20μl，可加緩沖液BB補足到200μl后進行后續步驟。
b.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。溶液應變清亮（但顏色偏黑色）。
可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
c.冷卻后加100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低產量，必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻。
d.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
e.接操作步驟項下5。

2.組織培養細胞
a.收集約105-106懸浮細胞到一個1.5ml離心管；對于貼壁細胞，應該先用胰蛋白酶消化后吹打下來收集。
b.13,000rpm離心10秒，使細胞沉淀下來。棄上清，留下細胞團和大約10-20μl殘留的液體。
c.加200μl 1XPBS重懸洗滌細胞，13,000rpm離心10秒，使細胞沉淀下來。完全吸棄上清, 將細胞沉淀重懸于180μl 1XPBS中。
d.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。
可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
e.冷卻后加100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
f.將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
g.接操作步驟項下5。

3.動植物組織（例如鼠肝腦或者植物葉片）
a.將20-50mg新鮮或者解凍的組織用解剖刀切成小碎塊（切成小塊可以提高產量）或者在液氮中研磨組織成細粉后，轉入裝有180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
b.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c.將裂解物放置在55℃水浴1-3小時或者直到組織消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
d.加入200μl 結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。
e.冷卻后加100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
f.用1ml的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
如果有不溶組織物可能堵住槍頭，可將槍頭在吸水紙上輕蹭去除不溶物；如果吸上來的混合物少則可以將槍頭和不溶物一起棄去，該做法是為了去除不溶物，以免堵塞離心柱。
g.接操作步驟項下5。

4.動物組織（鼠尾）
a.將0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎（一定要剪0-2cm范圍內的尾巴尖，否則裂解效果不好），或者在液氮中研磨組織成細粉后，轉入裝有180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
b.加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c.將裂解物放置在55℃水浴3小時或者直到組織消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
d.用一個1ml不帶針頭的一次性輸液器抽打裂解物2-3次。
e.加入200μl 結合液CB和100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。
f.13,000rpm 離心5分鐘，將上清加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

g.接操作步驟項下5。
上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低產量，必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻。

5.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

6.加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

8.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

9.取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預熱）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。

10.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在-20℃。

附錄（以300μl，1ml全血舉例紅細胞裂解操作）：
1.吸取900μl紅細胞裂解液到一個1.5ml離心管或者3ml紅細胞裂解液到一個15ml離心管。（紅細胞裂解液可向本公司購買）
2.將抗凝全血（使用前回復到室溫）顛倒混勻后，吸取300μl全血和1ml全血分別加到上述1.5ml和15ml離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。
3.室溫放置10分鐘（期間應該顛倒輕彈混勻數次，幫助裂解紅細胞）。
4.12,000 rpm離心20秒（對于1.5ml離心管）或2,000-3,000 rpm離心5分鐘（對于15ml離心管），倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細胞團），留下完整的管底白細胞團和大約10μl的殘留上清。
離心后在管底應該見到白色的白細胞團，也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細胞團，說明紅細胞裂解很不充分，應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團后重復3，4。
5.加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細胞團，充分分散白細胞團。
其中由于肝素抗凝血的白細胞沉淀團很難打散重懸，影響后續實驗裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標本。
6.現在可以按照操作提取全血基因組DNA了。